mikro pewarnaan

Identifikasi Mikroorganisme (Bakteri)

Mikroorganisme berasal dari kata micro: kecil dan organism: makhluk hidup, yaitu makhluk hidup berukuran kecil.

Tata cara penulisan species sesuai Binomial Nomenklatur:

ü  Huruf kata pertama ditulis dengan huruf kapital

ü  Huruf kata kedua ditulis dengan huruf kecil

ü  Kata pertama merupakan genus dan kata kedua merupakan spesies

ü  Diberi garis bawah terpisah atau dicetak miring

Contoh : Mycobacterium tubercolosis atau Mycobacterium tubercolosis

Ada berbagai cara untuk mengidentifikasi mikroorganisme melalui pengamatan mikroskop. Diantaranya adalah pengamatan dalam keadaan hidup dan pengamatan dengan pewarnaan.

a.      Pengamatan Hidup

Pengamatan mikroorganisme hidup memberikan ciri-ciri yang membantu dalam klasifikasi. Cara mikroorganisme memperoleh zat makanan, serta pergerakkannya hanya dapat dilihat pada waktu mikroorganisme tersebut hidup. Misalnya, bakteri dipisahkan menjadi bakteri yang bergerak (motil) dan bakteri yang tidak bergerak (non motil). Kelompok bakteri yang tidak bergerak dalam cairan terlihat bergerak pada tempat saja, gerakan seperti ini disebut gerak Brown. Gerakan Brown disebabkan benturan molekul air dengan bakteri. Makin kecil ukuran bakteri, makin kuat gerakan Brown. Sedangkan bakteri berukuran besar jarang memperlihatkan gerakan Brown. Adanya pergerakan aktif bakteri ini disebabkan oleh adanya flagel. Bakteri yang dapat bergerak seakan-akan terlihat seperti meluncur dalam cairan.

Untuk mengamati bakteri dalam keadaan hidup dapat dilakukan dua metode pengamatan, yaitu dengan menggunakan preparat basah dan preparat tetes gantung. Adapun cara untuk membuat preparat basah adalah dengan cara:

Ø  Kaca objek dibersihkan dengan kapas yang diberi alkohol.

Ø  Pindahkan dua mata ose suspensi biakan ke atas kaca objek. Pada preparat basah digunakan kaca objek biasa.

Ø  Tutuplah dengan kaca penutup.

Ø  Periksa dengan perbesaran 10x atau 40x

(Catatan : lakukan pemindahan suspensi bakteri ke kaca objek secara teknik aseptik)

Pengamatan bakteri dengan preparat tetes bergantung (hanging drop) lebih menguntungkan dibandingkan preparat basah karena dengan preparat tetes bergantung, suspensi bakteri tidak akan cepat kering. Pembuatan preparat tetes bergantung dapat dilakukan dengan cara:

Ø  Berikan vaselin pada sudut-sudut kaca penutup menggunakan tusuk gigi.

Ø  Taruhlah dua mata ose suspensi biakan bakteri di bagian tengah kaca penutup.

Ø  Kaca objek diletakan di atas kaca penutup, kemudian balikan dengan cepat.

Ø  Preparat tetes bergantung diperiksa dengan perbesaran 10x atau 40x

b.      Pengamatan dengan Pewarnaan

Pengamatan dengan pewarnaan dilakukan karena mikroorganisme akan sulit teramati dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Untuk mengatasi hal tersebut, maka dilakukan proses pewarnaan untuk mewarnai mikroorganisme atau latar belakangnya. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri ataupun latar belakangnya. Zat warna akan mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras antara mikroorganisme dengan sekelilingnya.

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen sel bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen sel bakteri maupun pada pewarna. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.

Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati netral dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif, sehingga pewarna asam yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel, maka sel tidak berwarna. Oleh sebab itu,  pewarna asam disebut pewarna negatif. Contoh pewarna asam misalnya: tinta cina, larutan Nigrosin, asam pikrat, dan eosin. Pewarna basa disebut pewarna positif, karena akan diikat oleh dinding sel bakteri sehingga sel bakteri jadi terwarna dan terlihat. Contoh dari pewarna basa misalnya metilin biru, kristal violet, safranin dan malakit hijau.

Dalam beberapa jenis pewarnaan, sebelum melakukan pewarnaan perlu disiapkan terlebih dahulu smear atau olesan bakteri. Langkah pembuatan smear sebagai berikut:

                    

Fiksasi adalah proses untuk menonaktifkan bakteri dengan pemanasan atau perendaman dengan etanol.

Tujuan fiksasi:

§  Untuk mengamati sel bakteri dengan jelas

§  Melekatkan bakteri pada kaca preparat/kaca objek

§  Untuk mematikan sel bakteri

PEWARNAAN SEDERHANA

Tujuan : Mempelajari kegunaan pewarnaan untuk mempertinggi kontras antara sel dan  kelilingnya dan mengamati ciri-ciri bakteri

·         Sel-sel M.O. yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang bila diamati dengan mikroskop cahaya.

·         Pewarna yang digunakan adalah satu jenis warna.

·         Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna sederhana karena sitoplasmanya basofilik (suka akan basa).

·         Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe mofrologi (kokus, basilus, vibrio, spirilum).

Gambar 1. Bentuk-bentuk bakteri

PEWARNAAN GRAM

Merupakan pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.

            Berikut merupakan larutan yang digunakan dalam pewarnaan gram dan urutan penggunaannya:

1.      Pewarna primer: Kristal Violet (KV), Ungu Kristal (UK)

Reaksi dan tampang bakteri

·      Gram positif : sel berwarna ungu

·      Gram negatif : sel berwarna ungu

2.      Mordant: Larutan Iodine (I)

Reaksi dan tampang bakteri

·      Gram positif : kompleks KV-I terbentuk dalam sel bakteri; sel tetap berwarna ungu

·      Gram negatif : kompleks KV-I terbentuk dalam sel bakteri; sel tetap berwarna ungu

3.      Perlakuan selektif: Alkohol/Etanol

Reaksi dan tampang bakteri

·         Gram positif : dinding sel mengalami dehidrasi, pori-pori menciut, daya rembes dinding sel dan membran menurun, KV-I tak dapat keluar dari sel; sel tetap ungu.

·         Gram negatif : lipid pada membran terekstraksi dari dinding sel, pori-pori mengembang, kompleks KV-I keluar dari sel; sel jadi tak berwarna.

4.      Counterstain : Safranin

Reaksi dan tampang bakteri

·         Gram positif : sel tidak terpengaruh; tetap berwarna ungu.

·         Gram negatif : sel menyerap zat pewarna safranin, sel menjadi berwarna merah muda/pink.

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah:

Ø  Fase yang paling kritis dari prosedur pewarnaan gram adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan KV-iodine lepas dari sel. Pemberian etanol/alkohol jangan sampai berlebih karena akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) karena tidak akan melarutkan KV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.

Ø  Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (KV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.

PEWARNAAN ACID-FAST

Pewarnaan acid-fast termasuk pewarnaan diferensial yang bertujuan untuk mempelajari dasar kimiawi sel bakteri terhadap reaksi tahan asam serta membedakan bakteri tahan asam (acid fast) dan tidak tahan asam (non acid fast). Bakteri acid-fast memiliki komponen seperti lilin pada dinding selnya yang membuat dinding tersebut sukar ditembus larutan. Namun, dinding tersebut menjadi mudah ditembus dengan larutan melalui pemanasan. Genus Mycobacterium dan Nocardia merupakan kelompok bakteri acid-fast. Pewarnaan acid-fast dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu metode Ziehl-Neelsen dan metode Kinyoun (pewarnaan dingin).

Prinsip Pewarnaan

Pemanasan akan membantu penyerapan zat warna primer (karbol fuchsin) melalui pemberian larutan pemucat (acid alcohol) bakteri tahan asam tetap berwarna merah sedangkan pada bakteri tidak tahan asam zat warna utama akan luntur sehingga pada penambahan warna kedua (Methylen blue) bakteri akan menyerap zat warna tersebut (biru).

PEWARNAAN GRANULA METAKROMATIK

Tujuannya adalah untuk mengamati ada tidaknya granula metakromatik/volution pada sel bakteri. Granula metakromatik merupakan kristal endapan yang dihasilkan bakteri ketika terdapat sisa fosfat dan karbohidrat pada media pertumbuhannya. Terdapat dua metode, yaitu metode Albert dan metode Loeffler.

Prinsip Pewarnaan

Pada prosedur Loeffler digunakan zat warna sederhana metilen biru. Granula tampak berwarna biru gelap dan sitoplasma bakteri berwarna biru terang.

PEWARNAAN NEGATIF

Bertujuan untuk mengamati morfologi organisme yang sukar diwarnai oleh pewarna sederhana. Metode pewarnaan ini bukan untuk mewarnai bakteri, tetapi untuk mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel bakteri.

ü  Pewarnaan negatif dilakukan dengan mencampurkan M.O. dengan setetes tinta India (Nigrosin) lalu menyebarkannya diatas sebuah kaca obyek.

ü  M.O tampak transparan (tembus pandang) dan tampak jelas diantara latar dan medan yang gelap.

ü  Tidak mengalami pemanasan dan perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, agar tidak terjadi penyusutan sel sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat.

PEWARNAAN KAPSUL

            Kapsul adalah lapisan lendir yang terdapat di sekeliling sel, yang disekresikan oleh sel bakteri dan melingkupi dinding sel. Tidak semua mikroorganisme memiliki kapsul. Adanya kapsul berhubungan dengan virulensi bakteri dan memiliki kemampuan menyebabkan penyakit.

            Fungsi kapsul antara lain sebagai cadangan makanan, perlindungan terhadap fagositosis dan dehidrasi. Kemampuan bakteri menghasilkan kapsul bersifat genetis, tetapi produksinya sangat dipengaruhi oleh media pertumbuhan bakteri. Komposisi kimia kapsul dapat berupa polisakarida, glikoprotein, atau polipeptida.

            Pewarnaan kapsulpaling susah dibandingkan pewarnaan lainnya, karena kapsul mudah larut dalam air dan dapat berubah tempat atau tercuci pada saat pencucian. Fiksasi tidak boleh dipanaskan, karena pemanasan dapat membuat sel mengkerut sehingga terdapat bagian kosong antara sel dengan kapsul, maka pengamatan dapat keliru.

PEWARNAAN ENDOSPORA

            Bakteri tertentu seperti Clostridium, Desulfumoculatum (anaerob) dan Bacillus (aerob) mempunyai kemampuan untuk membentuk suatu struktur dalam sel pada tempat-tempat yang khas, disebut endospora. Endospora dibentuk apabila kondisi lingkungan tidak memungkinkan untuk kelangsungan hidup sel vegetatif bakteri. Endospora merupakan bentuk kehidupan yang paling resisten dan dapat bertahan dalam keadaan kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, dan unsur-unsur fisik lainnya seperti pembekuan, kekeringan, radiasi dan bahan-bahan kimia yang dapat menghancurkan bakteri yang tidak membentuk endospora. Endospora dikelilingi oleh suatu lapisan yang kedap air (impermeabel) yang disebut selubung spora. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas.

Letak endospora

1.      Sentralis 

2.      Terminalis

3.      Sub terminalis                      1                         2                         3

Tahapan Sporulasi (pembentukan dari bakteri menjadi spora)

§  Pertumbuhan sel vegetatif menjadi lambat

§  Membran sel mengkerut ke bagian tengah atau ujung

§  Terbentuk lapisan dinding sel yang bersifat permeabel (dapat menyerap cairan terutama yang menguntungkan bakteri)

§  Membentuk endospora

Prinsip Pewarnaan

Pemanasan akan mengembangkan lapisan luar endospora sehingga zat warna primer (malakit hijau) dapat masuk masuk ke dalam endospora sehingga berwarna hijau. Melalui pendinginan warna primer akan terperangkap di dalam spora, dengan pencucian zat warna primer yang ada pada sel vegetatif akan terlepas sehingga pada saat debri counterstain dengan safranin, sel vegetatif akan berwarna merah.

PEWARNAAN FLAGELLA

            Flagel merupakan salah satu alat gerak bakteri. Flagel mengakibatkan bakteri dapat bergerak berputar. Penyusun flagel adalah sub unit protein yang disebut flagelin, yang mempunyai berat molekul rendah. Berdasarkan jumlah dan letak flagelnya, bakteri dibedakan menjadi monotrik, lopotrik, amfitrik, peritrik dan atrik.

            Prinsip pewarnaan flagella adalah membuat organel tersebut dapat dilihat dengan cara melapisinya dengan mordant dalam jumlah yang cukup. Dua metode pewarnaan flagella, yaitu metode Gray dan metode Leifson. Metode Gray digunakan untuk mendapat hasil yang lebih baik dan mengena walaupun dalam metode ini tidak dilakukan pencelupan yang khusus.